O diagnóstico laboratorial dos vírus em geral, depende essencialmente do conhecimento da estrutura viral bem como de seu material genético (Figura1). No caso do SARS-CoV-19, o material genético é RNA+, a estrutura viral que protege o ácido nucleico viral está bem estabelecida graças a genética reversa.

A replicação viral segue as seguintes etapas:

1. Adsorção (Spike/receptor);
2. Liberação genoma Viral p/ interior celular;
3. Tradução de enzimas do complexo; Replicação/Transcrição (pol1ab);
4. Transcrição do RNAm em segmentos de polaridade negativa;
5. Transcrição do RNAm em segmentos de polaridade +;
6. Tradução de proteínas estruturais;
7. Replicação do RNA gênomico;
8. Composição do novo vírion;
9. Liberação da partícula viral.

A replicação viral não é estática e existe um tempo que vai desde a adsorção do vírus as células hospedeiras até a liberação de novas partículas virais. O SARS-Cov-19 é liberado da célula por brotamento, e não por lise celular. Após a saída da célula, o vírus adsove nas células vizinhas e, assim, sucessivamente. Como ainda não há um estudo sobre o tempo da replicação do coronavirus desde a entrada do vírus na célula até a saída da nova partícula viral, o aparecimento de IgM e IgG ainda não está bem definido, embora desde dezembro de 2019, mais de 600 publicações tenham sido colocadas à disposição da Sociedade Científica.

Diagnóstico Laboratorial

O padrão ouro em se tratando de vírus, ė a cultura de tecido, onde o antígeno, ou seja, o vírus é isolado. Com o advento da engenharia genética e a genética reversa, atualmente o padrão ouro é a reação em cadeia da polimerase (PCR), que detecta o ácido nucleico, no caso em tela, RNA+.

Um único resultado não detectado com RT-PCR para SARS-CoV-2 não exclui o diagnóstico da COVID-19. Vários fatores como coleta inadequada da amostra, tipo de amostra biológica, tempo decorrido entre a coleta e o início dos sintomas, e oscilação da carga viral podem influenciar o resultado do exame. Sempre que houver discordância com o quadro clínico epidemiológico, o exame de RT-PCR deve ser repetido em outra amostra do trato respiratório.
A sensibilidade de diferentes amostras biológicas para detecção do SARS CoV2 varia. Um estudo que avaliou 1070 amostras de 250 pacientes com COVID 19, observou os seguintes valores de sensibilidade para as diferentes amostras testadas por RT PCR: lavado broncoalveolar 93%, escarro 72%, swab nasal 63%, swab de orofaringe 32%, fezes 29%, sangue 1% e urina 0% (JAMA. 2020 Mar 11. doi: 10.1001/jama.2020.3786).

Como o intervalo de tempo para o pico dos níveis virais na COVID-19 ainda é desconhecido, o tempo ótimo para a coleta das amostras biológicas para o diagnóstico da infecção não foi estabelecido. Um estudo chinês descreveu que 3,0% de 167 pacientes com evidência de COVID-19 na tomografia de tórax inicialmente apresentaram RT-PCR negativa. Posteriormente, o swab de todos os pacientes converteu a positivo, em um intervalo médio de 5 a 7 dias (Xingzhi Xie et al. Radiology , https://doi.org/10.1148/radiol.2020200343).

Por fim, um estudo publicado com uma série de casos demonstrou que a carga viral de pacientes nos quais foram realizadas múltiplas coletas de swab de orofaringe e nasofaringe oscila ao longo do tempo. Um mesmo paciente pode apresentar o vírus detectado na amostra coletada em um dia e não detectado em amostra coletada em outro dia (N Engl J Med, 382 (12), 1177-1179).

Portanto, eventualmente, a coleta de múltiplas amostras, de locais e tempo diferentes durante a evolução da doença, pode ser necessária para o diagnóstico da COVID-19.

Importante lembrar que o teste avalia a presença de RNA viral na amostra. A persistência do exame positivo não significa necessariamente que o paciente ainda está infectado. O período que os pacientes permanecem infectantes ainda não está totalmente esclarecido e a utilização dos testes para liberação do paciente do isolamento respiratório deve ser avaliada criteriosamente pelos motivos acima descritos.

Fontes:

China CDC Primers and probes for detection 2019-nCoV (24 January 2020)

Diagnostic detection of Wuhan coronavirus 2019 by real-time RT-PCR – Charité, Berlin Germany (17 January 2020)

Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases by RT-PCR – Hong Kong University (23 January 2020)

PCR and sequencing protocol for 2019-nCoV – Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand (Updated 28 January 2020)

PCR and sequencing protocols for 2019-nCoV- National Institute of Infectious Diseases Japan (24 January 2020)

US CDC Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus  (28 January 2020)

US CDC panel primer and probes– U.S. CDC, USA (28 January 2020)

Real-time RT-PCR assays for the detection of SARS-CoV-2 Institut Pasteur, Paris (2 March 2020)

Autor: Maria Elizabeth Menezes

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